Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

From 2011.igem.org

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         GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>   
         GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>   
Tm値<br>  
Tm値<br>  
-
　　　  62 ゜C<br>
+
　　　  62 °C<br>
R primer<br>
R primer<br>
  　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
  　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
Tm値<br>       
Tm値<br>       
-
         66.4゜C<br>
+
         66.4°C<br>
増幅サイズ　　約1514 bp<br>
増幅サイズ　　約1514 bp<br>
<br>
<br>
Line 33: Line 33:
<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-
<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl or 4 µl</td></tr>
+
<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl</td></tr>
-
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl or 31 µl</td></tr>
+
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl</td></tr>
<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
Line 46: Line 46:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
</table>
</table>
Line 73: Line 73:
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/f/f4/2011.09.13_DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/f/f4/2011.09.13_DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
-
<br>
+
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2<br>
 +
期待される場所にバンドが見られた。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 107: Line 108:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 119: Line 120:
       GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
       GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
Tm値<br>   
Tm値<br>   
-
       57.8 ゜C<br>  
+
       57.8 °C<br>  
R primer<br>
R primer<br>
       GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
       GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
Tm値<br>
Tm値<br>
-
       56.5 ゜C<br>  
+
       56.5 °C<br>  
増幅サイズ　　約3131 bp<br>　  
増幅サイズ　　約3131 bp<br>　  
<br>
<br>
Line 139: Line 140:
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/ed/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%92.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
 +
【結果】<br>
 +
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 150: Line 154:
【実験方法】<br>
【実験方法】<br>
以下の条件でPCRを行った。<BR>
以下の条件でPCRを行った。<BR>
 +
・API2-MALT1<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
<BR>
 +
・DIAP2<br>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0" width="150px">
<table border="0" width="150px">
Line 186: Line 221:
         GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<BR>
         GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<BR>
Tm値<br>
Tm値<br>
-
         62゜C<br>
+
         62°C<br>
R primer<br>  
R primer<br>  
         GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
         GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
Tm値<BR>
Tm値<BR>
-
         66.4゜C<br>
+
         66.4°C<br>
増幅サイズ<BR>
増幅サイズ<BR>
     　　約1514 bp<br>
     　　約1514 bp<br>
Line 207: Line 242:
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/8/86/2011.09.15_%E6%9D%BE%E6%B5%AA.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
 +
【結果】<br>
 +
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1<br>
 +
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 214: Line 253:
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
Line 253: Line 292:
-
37°Cで20時間静置した。
+
37°Cで20時間静置した。<br>
-
 
+
<BR>
<BR>
-
 
+
<br>
 +
<br>
9月16日（金）<br>
9月16日（金）<br>
<br>
<br>
Line 266: Line 305:
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
<br>
<br>
下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
 +
 +
<TABLE border="0"><TR><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>DIAP2</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD><TD></TD><TD></TD><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>API2-MALT1</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x L Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Nhe</I> Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD></TR>
 +
</TABLE>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9月17日（土）<br>
 +
<br>
 +
松浪<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
制限酵素処理の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。<br>
 +
<table border="1" width="200px">
 +
<tr><td width="140px" align=center>DIAP2</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。<br>
 +
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e9/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%91.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
 +
【結果】<br>
 +
マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。<br>
 +
<br>
<br>
<br>
9月18日（日）<br>
9月18日（日）<br>
Line 285: Line 370:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
コンピテントセルの作成<br>
+
コンピテントセル（DH5α）の作成<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 332: Line 417:
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。<BR>
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。<BR>
 +
<br>
 +
<br>
9月21日（水）<br>
9月21日（水）<br>
<br>
<br>
Line 341: Line 428:
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。<br>
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
・DIAP2<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
<BR>
 +
上記の条件でPCRを行った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
PCR産物の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
<table border="1" width="200px">
 +
<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 +
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/4/44/2011.09.21_DIAP2.2-7.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
 +
【結果】<br>
 +
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2<br>
 +
全てのサンプルでPCRが成功した。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
PCR産物の制限酵素処理<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
 +
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
 +
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 +
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
 +
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 +
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
 +
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
 +
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
 +
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
 +
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
 +
<br>
 +
下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
 +
 +
<TABLE border="0"><TR><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>cDNA</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
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9月22日（木）<br>
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【目的】<br>
 +
PCR産物の制限酵素処理<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
 +
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
 +
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 +
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
 +
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 +
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
 +
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
 +
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
 +
↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
 +
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
 +
<br>
 +
下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
 +
 +
<TABLE border="0"><TR><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>DIAP2</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
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9月23日（金）<br>
 +
<br>
 +
松浪<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
制限酵素処理の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。<br>
 +
<table border="1" width="200px">
 +
<tr><td width="140px" align=center>DIAP2</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。<br>
 +
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/1/1f/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%94.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
 +
【結果】<br>
 +
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。<br>
 +
<br>
 +
<br>
9月25日（日）<br>
9月25日（日）<br>
<br>
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Line 346: Line 571:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
コンピテントセルの作成<br>
+
コンピテントセル(DH5α)の作成<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 383: Line 608:
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。<BR>
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。<BR>
 +
<br>
 +
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9月27日（火）<br>
9月27日（火）<br>
<br>
<br>
Line 392: Line 619:
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
↓OD<sob>600</sub>＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。<BR>
↓OD<sob>600</sub>＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。<BR>
-
↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+
↓4°Cで10min遠心(4.5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓氷上で10 min保冷した。<BR>
↓氷上で10 min保冷した。<BR>
-
↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+
↓4°Cで10min遠心(5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。<BR>
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。<BR>
Line 401: Line 628:
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。<BR>
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。<BR>
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-
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-
9月28日（水）<br>
 
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松浪<br>
 
-
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【目的】<br>
 
-
コンピテンシーの測定<br>
 
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【実験操作】<br>
 
-
 
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Latest revision as of 09:17, 4 October 2011

9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 °C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min40sec
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2
期待される場所にバンドが見られた。


9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 °C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 °C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62°C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ
　　約1514 bp


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置した。



9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl
API2-MALT1
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x L Buffer5 µl
Nhe Ⅰ1 µl
 total 50 µl


9月17日（土）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。
DIAP22 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。


9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル（DH5α）の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加した。
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。


9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

【目的】
・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2
全てのサンプルでPCRが成功した。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl


9月22日（木）
【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl


9月23日（金）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。
DIAP22 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。


9月25日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル(DH5α)の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせた。
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加した。
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。


9月27日（火）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓OD600＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。
↓4°Cで10min遠心(4.5 x 103 g)した。
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓氷上で10 min保冷した。
↓4°Cで10min遠心(5 x 103 g)した。
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。



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