Team:KIT-Kyoto/matsunami/8月

From 2011.igem.org

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Line 35: Line 35:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 67: Line 67:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 81: Line 81:
・DIAP2<br>
・DIAP2<br>
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>
-
Tm値 69゜C<br>
+
Tm値 69°C<br>
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
-
Tm値 66.4゜C<br>
+
Tm値 66.4°C<br>
増幅サイズ  約1514 bp<br>
増幅サイズ  約1514 bp<br>
<br>
<br>
・API2-MALT1<br>  
・API2-MALT1<br>  
-
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
+
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
-
Tm値 57.8゜C<br>
+
Tm値 57.8°C<br>
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
-
Tm値 56.5゜C<br>
+
Tm値 56.5°C<br>
増幅サイズ  約3131 bp<br>
増幅サイズ  約3131 bp<br>
-
 
<br>
<br>
<br>
<br>
-
 
8月9日(火)<br>
8月9日(火)<br>
<br>
<br>
Line 110: Line 108:
<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
</table>
</table>
-
 
<br>
<br>
-
 
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
-
 
+
1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2<br>
 +
2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
-
 
【目的】<br>
【目的】<br>
pUAST溶液の形質転換<br>
pUAST溶液の形質転換<br>
-
 
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
 
↓pUAST 1 µlとコンピテントセルを混合した。<br>
↓pUAST 1 µlとコンピテントセルを混合した。<br>
↓これを氷上で15min放置した。<br>
↓これを氷上で15min放置した。<br>
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。<br>
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。<br>
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。<br>
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。<br>
-
 
<br>
<br>
-
 
+
<br>
8月10日(水)<br>
8月10日(水)<br>
<br>
<br>
Line 142: Line 135:
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
 +
・API2-MALT1<br>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0" width="150px">
<table border="0" width="150px">
Line 163: Line 157:
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 170: Line 164:
</td></tr>
</td></tr>
</table>
</table>
-
 
<BR>
<BR>
-
 
+
・DIAP2<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
<br>
下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
右に示したプログラムで反応を行った。<br>
右に示したプログラムで反応を行った。<br>
Line 183: Line 205:
↓ついた先端を2個のLB培地(amp+)2 mlに攪拌した。<br>
↓ついた先端を2個のLB培地(amp+)2 mlに攪拌した。<br>
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。<br>
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。<br>
-
 
<br>
<br>
-
 
+
<br>
8月11日(木)<br>
8月11日(木)<br>
<br>
<br>
Line 195: Line 216:
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
↓培養液1.5 mLを、15000 rpm、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。<br>
+
↓培養液1.5 mLを、15000 g、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。<br>
↓上清を廃棄しglucose solution 100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。<br>
↓上清を廃棄しglucose solution 100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。<br>
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
-
↓15000 rpm、10min、4°Cの条件で遠心した。<br>
+
↓15000 g、10min、4°Cの条件で遠心した。<br>
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。<br>
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。<br>
-
↓15000 rpm、10min、25°Cの条件で遠心した。<br>
+
↓15000 g、10min、25°Cの条件で遠心した。<br>
-
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 rpm、10min、25°Cの条件で再び遠心した。<br>
+
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 g、10min、25°Cの条件で再び遠心した。<br>
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。<br>
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。<br>
 <br>
 <br>
Line 218: Line 239:
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/2/21/2011.08.11_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/2/21/2011.08.11_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
-
 
+
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~9レーン;pUAST、10レーン;flag、11レーン;API2-MALT1、12レーン;DIAP2<br>
 +
pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。<br>
 +
<br>
<br>
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-
 
8月12日(金)<br>
8月12日(金)<br>
<br>
<br>
Line 230: Line 252:
vectorの大量精製<br>
vectorの大量精製<br>
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<br>
 +
<BR>
 +
 +
 +
<p><strong>midi prep</strong></p>
 +
<a herf="http://toolsja.invitrogen.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_dna_purification_man.pdf">invitrogen PureLink<sup>TM</sup> HiPure Plasmid DNA Purification Kits</a>を使用する<BR>
 +
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
Line 251: Line 279:
<table border=1 width="500px">
<table border=1 width="500px">
<tr><td width="100px" align=rjght>0.189</td><td width="100px" align=rjght>0.208</td><td width="100px" align=rjght>0.192</td><td width="100px" align=rjght>0.190</td><td width="100px" align=rjght>0.191</td></tr></table>
<tr><td width="100px" align=rjght>0.189</td><td width="100px" align=rjght>0.208</td><td width="100px" align=rjght>0.192</td><td width="100px" align=rjght>0.190</td><td width="100px" align=rjght>0.191</td></tr></table>
-
 
<br>
<br>
平均は0.194であった。<br>
平均は0.194であった。<br>
Line 259: Line 286:
<table border=1 width="500px">
<table border=1 width="500px">
<tr><td width="100px" align=rjght>0.282</td><td width="100px" align=rjght>0.276</td><td width="100px" align=rjght>0.278</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td></tr></table>
<tr><td width="100px" align=rjght>0.282</td><td width="100px" align=rjght>0.276</td><td width="100px" align=rjght>0.278</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td></tr></table>
-
 
<br>
<br>
平均は0.275でった。<br>
平均は0.275でった。<br>
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。<br>
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。<br>
-
 
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
Line 277: Line 302:
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
-
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/ce/8.26GFP%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD.jpg" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/3/30/2011.08.14_%E6%9D%BE%E6%B5%AA.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
<br>
<br>
-
 
<br>
<br>
8月15日(月)<br>
8月15日(月)<br>
Line 314: Line 338:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 344: Line 368:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 350: Line 374:
</td></tr>
</td></tr>
</table>
</table>
-
 
-
 
-
 
<BR>
<BR>
-
 
下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
右に示したプログラムで反応を行った。<br>
右に示したプログラムで反応を行った。<br>
Line 372: Line 392:
<br>
<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/0/0c/2011.08.15_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/0/0c/2011.08.15_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
-
 
+
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2<br>
-
 
+
API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。<br>
 +
<br>
<br>
<br>
8月16日(火)<br>
8月16日(火)<br>
Line 407: Line 428:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 437: Line 458:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 443: Line 464:
</td></tr>
</td></tr>
</table>
</table>
-
 
-
 
-
 
-
 
-
 
-
 
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
Line 463: Line 478:
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/c3/2011.08.16_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/c3/2011.08.16_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
-
 
+
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2<br>
-
<br>
+
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。<br>
-
 
+
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 501: Line 515:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 531: Line 545:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 537: Line 551:
</td></tr>
</td></tr>
</table>
</table>
-
 
+
<br>
-
 
+
-
 
+
-
 
+
【目的】<br>
【目的】<br>
 PCR産物の確認<br>
 PCR産物の確認<br>
Line 554: Line 565:
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/9/98/2011.08.17_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/9/98/2011.08.17_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
-
 
+
右から順に1レーン;マーカー、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2<br>
-
 
+
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。<br>
 +
<br>
<br>
<br>
-
  
 
-
 
8/23(火)<br>
8/23(火)<br>
<br>
<br>
Line 592: Line 602:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
</table>
</table>
Line 622: Line 632:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
</table>
</table>
</td></tr>
</td></tr>
</table>
</table>
-
 
+
<br>
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+
-
 
+
-
+
上記の条件でPCRを行った。<br>
上記の条件でPCRを行った。<br>
<br>
<br>
Line 645: Line 652:
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
-
<br>
+
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/6/68/2011.08.23_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
 +
【結果】<br>
 +
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2、5レーン;DIAP2<br>
 +
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 679: Line 689:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 701: Line 711:
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e6/2011.08.24_API2-MALT1_10.100%E5%80%8D%E5%B8%8C%E9%87%88.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e6/2011.08.24_API2-MALT1_10.100%E5%80%8D%E5%B8%8C%E9%87%88.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
 +
左から順に2レーン;マーカー、3~6レーン;API2-MALT1(10倍希釈)、8~11レーン;API2-MALT1(100倍希釈)<br>
 +
バンドは何も見られなかった。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 735: Line 747:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 766: Line 778:
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
</table>
</table>
Line 788: Line 800:
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/7/72/2011.08.25_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/7/72/2011.08.25_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
 +
【結果】<br>
 +
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4・5レーン;DIAP2<br>
 +
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。<br>

Latest revision as of 12:26, 4 October 2011

8月8日(月)

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling56.9°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

*<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値 69°C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値 66.4°C
増幅サイズ  約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値 57.8°C
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値 56.5°C
増幅サイズ  約3131 bp


8月9日(火)

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2
2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。


【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
↓pUAST 1 µlとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15min放置した。
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。


8月10日(水)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling56.9°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
大腸菌の培養

【実験操作】
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB(amp+)プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地(amp+)2 mlに攪拌した。
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。


8月11日(木)

松浪

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養液1.5 mLを、15000 g、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓上清を廃棄しglucose solution 100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓15000 g、10min、4°Cの条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。
↓15000 g、10min、25°Cの条件で遠心した。
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 g、10min、25°Cの条件で再び遠心した。
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。
 
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~9レーン;pUAST、10レーン;flag、11レーン;API2-MALT1、12レーン;DIAP2
pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。


8月12日(金)

松浪、横井川

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製


midi prep

invitrogen PureLinkTM HiPure Plasmid DNA Purification Kitsを使用する
【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。
↓70% EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。

↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
↓ddH2O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓ddH2O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す(表1)。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1
0.1890.2080.1920.1900.191

平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。

サンプル5
0.2820.2760.2780.2690.269

平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】


8月15日(月)

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling58.9°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【結果】
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2
API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。


8月16日(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling58.9°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。


8月17日(水)

松浪、横井川


【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
右から順に1レーン;マーカー、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。


8/23(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension68°C3min20sec
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min40sec
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2、5レーン;DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。


8月24日(水)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
鋳型DNAを10、100倍希釈後、上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に2レーン;マーカー、3~6レーン;API2-MALT1(10倍希釈)、8~11レーン;API2-MALT1(100倍希釈)
バンドは何も見られなかった。


8月25日(木)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min40sec
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4・5レーン;DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。