Team:KIT-Kyoto/matsunami

From 2011.igem.org

(Difference between revisions)
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<html>
<html>
-
<head>
+
 
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
-
<title></title>
+
-
</head>
+
<body>
<body>
-
<p>8月8日（月）<br>
+
 
 +
8月8日（月）<br>
<br>
<br>
松浪、横井川<br>
松浪、横井川<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
　（1）PCR反応液の調製<br>
+
（1）PCR反応液の調製<font color=red>←てーぶるこぷぺしなおしてね！！！</font><br>
＊DIAP2
＊DIAP2
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
Line 102: Line 100:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
   
   
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 115: Line 113:
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
Line 121: Line 119:
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　pUAST溶液の形質転換<br>
+
pUAST溶液の形質転換<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
　pUAST　1&nbsp;&micro;Lとコンピテントセルを混合した。<br>
+
↓pUAST　1 µlとコンピテントセルを混合した。<br>
-
　↓これを氷上で15分間放置した。<br>
+
↓これを氷上で15min放置した。<br>
 +
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。<br>
 +
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。<br>
-
　↓43℃で30秒間温め、氷上で10分間放置した。<br>
 
-
　これをLBプレートに塗り37℃でincubateした。<br>
 
-
<br>
 
-
<br>
 
<br>
<br>
 +
8月10日（水）<br>
8月10日（水）<br>
<br>
<br>
Line 138: Line 135:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
　8月8日と同様である。<br>
+
8月8日と同様である。<font color=red>←ちゃんと書く！！！！！！！</font><br>
<br>
<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　大腸菌の培養<br>
+
大腸菌の培養<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
　ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。<br>
+
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。<br>
-
　↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2mLに攪拌した。<br>
+
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。<br>
-
　pUASTとコンピテントセルの混合物を10&nbsp;&micro;L、100
+
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。<br>
-
&micro;Lをそれぞれまいた。<br>
+
 
-
<br>
+
<br>
<br>
 +
8月11日（木）<br>
8月11日（木）<br>
<br>
<br>
Line 160: Line 157:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　pUAST flag  
+
pUAST flag  
vectorの大量精製<br>
vectorの大量精製<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
　培養液1.5 mLを、15000rpm、5分、4℃の条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。<br>
+
↓培養液1.5 mLを、15000 rpm、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。<br>
-
　↓5分後、上清を廃棄しglucose solution　100 &micro;L加えて攪拌した。<br>
+
↓上清を廃棄しglucose solution　100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。<br>
-
　↓沈殿物を溶解した後、0.2N NaOH 1% SDS 200 &micro;Lを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。<br>
+
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
-
　↓5分後、5M K-acetate pH 4.8 150 &micro;Lを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。<br>
+
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
-
　↓5分後、15000rpm、10分、4℃の条件で遠心した。<br>
+
↓15000 rpm、10min、4°Cの条件で遠心した。<br>
-
　↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3分間静置した。<br>
+
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。<br>
-
　↓3分後、15000rpm、10分、25℃の条件で遠心した。<br>
+
↓15000 rpm、10min、25°Cの条件で遠心した。<br>
-
　↓遠心後、上清を廃棄し70% EtOH 200 &micro;Lを加えて軽く攪拌し3分間静置した。その後、15000rpm、10分、25℃の条件で再び遠心した。<br>
+
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 rpm、10min、25°Cの条件で再び遠心した。<br>
-
　遠心後、上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 &micro;Lを加えた。<br>
+
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。<br>
　<br>
　<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 184: Line 181:
</table>
</table>
-
&nbsp; 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100  
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
-
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
<br>
<br>
-
<br>
+
 
-
<br>
+
8月12日（金）<br>
8月12日（金）<br>
<br>
<br>
Line 196: Line 191:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　pUAST
+
pUAST flag  
-
flag  
+
vectorの大量精製<br>
vectorの大量精製<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
-
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
+
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。<br>
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。<br>
-
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5分間室温で静置した。<br>
+
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。<br>
-
↓5分後、N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
+
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。<br>
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。<br>
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。<br>
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。<br>
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。<br>
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。<br>
-
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000G、40分、4℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
+
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。<br>
-
↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5分、4℃の条件で再び遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
+
↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。<br>
-
↓Air-dryで乾燥させ200 &micro;LでのTEに溶かした。<br>
+
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。<br>
 +
<br>
 +
↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。<br>
 +
↓ddH<sub>2</sub>O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。<br>
 +
↓ddH<sub>2</sub>O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。<br>
 +
 
 +
 
 +
表1、サンプル1、5の吸光度の値<br>
 +
サンプル1<br>
 +
<table border=1 width="500px">
 +
<tr><td width="100px" align=rjght>0.189</td><td width="100px" align=rjght>0.208</td><td width="100px" align=rjght>0.192</td><td width="100px" align=rjght>0.190</td><td width="100px" align=rjght>0.191</td></tr><table>
 +
 
<br>
<br>
-
　次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。<br>
 
-
　milliQ 100 &micro;Lおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。<br>
 
-
　↓milliQ 100 &micro;Lでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。<br>
 
-
　　　　　　　　　　　　　　　　表1、サンプル1、5の吸光度の値<br>
 
-
　<br>
 
-
　サンプル1<br>
 
-
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="75%">
+
　平均は0.194であった。<br>
-
  <tr>
+
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。<br>
-
    <td>　0.189</td>
+
-
    <td>　0.208</td>
+
-
    <td>0.192　</td>
+
-
    <td>0.190　</td>
+
-
    <td>0.191　</td>
+
-
  </tr>
+
-
</table>平均は0.194であった。<br>
+
-
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970  
+
-
&micro;g/&micro;Lであった。<br>
+
<br>
<br>
サンプル5<br>
サンプル5<br>
 +
<table border=1 width="500px">
 +
<tr><td width="100px" align=rjght>0.282</td><td width="100px" align=rjght>0.276</td><td width="100px" align=rjght>0.278</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td></tr><table>
 +
 +
<br>
 +
 +
平均は0.275でった。<br>
 +
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。<br>
-
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="75%">
 
-
  <tr>
 
-
    <td>　0.282</td>
 
-
    <td>0.276　</td>
 
-
    <td>0.278　</td>
 
-
    <td>0.269　</td>
 
-
    <td>0.269　</td>
 
-
  </tr>
 
-
</table>平均は0.275でった。<br>
 
-
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37
 
-
&micro;g/&micro;Lであった。<br>
 
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<br>  
-
&nbsp;&nbsp;PCR反応液　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<table border="1" width="200px">
<table border="1" width="200px">
<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
Line 256: Line 241:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
Line 266: Line 251:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
+
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
-
　8月8日と同じであるが、Annealing&nbsp;について以下のように変更した。<br>
+
8月8日と同じであるが、Annealingについて以下のように変更した。<br>
-
　DIAP2&nbsp;&nbsp;  
+
DIAP2&nbsp;&nbsp;  
　　　&nbsp;&nbsp;　　　　  
　　　&nbsp;&nbsp;　　　　  
56.9℃<br>
56.9℃<br>
-
　API2-MALT1  
+
API2-MALT1  
　　　　　53℃<br>
　　　　　53℃<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 287: Line 271:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
Line 297: Line 281:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
+
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
-
　8月8日と同じであるが、Annealing&nbsp;について以下のように変更した。<br>
+
8月8日と同じであるが、Annealingについて以下のように変更した。<br>
-
　DIAP2&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
+
DIAP2&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
　　　&nbsp;&nbsp;　　  
　　　&nbsp;&nbsp;　　  
　　　　  
　　　　  
58.9℃<br>
58.9℃<br>
-
　API2-MALT1&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
+
API2-MALT1&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
　　　　　53℃<br>
　　　　　53℃<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 319: Line 302:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
Line 331: Line 314:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
+
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
-
　8月8日と同じであるが、Annealing&nbsp;について以下のように変更した。<br>
+
8月8日と同じであるが、Annealing&nbsp;について以下のように変更した。<br>
-
　DIAP2　　　　&nbsp;&nbsp;　　  
+
DIAP2　　　　&nbsp;&nbsp;　　  
　　　　  
　　　　  
50.5℃<br>
50.5℃<br>
-
　API2-MALT1　　　　　　　  
+
API2-MALT1　　　　　　　  
53.5℃<br>
53.5℃<br>
<br>
<br>
Line 352: Line 334:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
-
　　　
+
　　
-
</body>
+
-
</html>
+
-
 
+
８/23(火)<br>
-
<html>
+
-
<head>
+
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
-
<title></title>
+
-
</head>
+
-
<body>
+
-
<p>８/23(火)<br>
+
<br>
<br>
松浪<br>
松浪<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
Line 448: Line 420:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 457: Line 429:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 467: Line 439:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
Line 523: Line 494:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 532: Line 503:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 541: Line 512:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
　 ・API2-MALT1<br>
　 ・API2-MALT1<br>
&nbsp;  
&nbsp;  
Line 651: Line 621:
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 660: Line 630:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
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9月12日（月）
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<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
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<title></title>
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<p>9月12日（月）<br>
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松浪、横井川<br>
松浪、横井川<br>
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【目的】<br>
【目的】<br>
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　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+
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<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
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<br>
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【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 775: Line 734:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
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<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
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　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
　（1）PCR反応液の調製<br>
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
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<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 871: Line 829:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
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<br>
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【目的】<br>
【目的】<br>
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　cDNA
+
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
-
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+
<br>
<br>
【実験方法】<br>
【実験方法】<br>
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　 <br>
　 <br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の確認<br>
+
PCR産物の確認<br>
<br>
<br>
【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
Line 947: Line 904:
</table>
</table>
-
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br>
+
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
-
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の制限酵素処理<br>
+
PCR産物の制限酵素処理<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるをコピペする！！</font><br>
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
　　　PCR産物を400  
　　　PCR産物を400  
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<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
-
　PCR産物の制限酵素処理<br>
+
PCR産物の制限酵素処理<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<br>
+
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるをコピペする！！</font><br>
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
　　　PCR産物を400  
　　　PCR産物を400  
Line 1,013: Line 970:
<br>
<br>
<br>
<br>
-
</p>
+
 
</body>
</body>
</html>
</html>

Revision as of 06:49, 26 September 2011

8月8日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
（1）PCR反応液の調製←てーぶるこぷぺしなおしてね！！！
＊DIAP2

PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
鋳型 DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
dNTPs(2.0 µM)2 µl
ddH2O14.1 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
 全量 20 µl
Cycle条件
Start94°C、2分
Cycle x 3094°C、15秒(熱変性)
56.9°C、30秒(アニーリング)
72°C、100秒(伸長)
End4°Cで保持

＊API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
鋳型 DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
dNTPs(2.0 µM)2 µl
ddH2O14.1 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
 全量 20 µl
Cycle条件
Start94°C、2分
Cycle x 3094°C、15秒(熱変性)
51.5°C、30秒(アニーリング)
72°C、3分20秒(伸長)
End4°Cで保持
上記の分量を混合した。

＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値　69゜C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値　66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT Tm値　57.8゜C
R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値　56.5゜C
増幅サイズ　　約3131 bp


8月9日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
↓pUAST　1 µlとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15min放置した。
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。

8月10日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
8月8日と同様である。←ちゃんと書く！！！！！！！


【目的】
大腸菌の培養

【実験操作】
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。

8月11日（木）

松浪

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養液1.5 mLを、15000 rpm、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓上清を廃棄しglucose solution　100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓15000 rpm、10min、4°Cの条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。
↓15000 rpm、10min、25°Cの条件で遠心した。
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 rpm、10min、25°Cの条件で再び遠心した。
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。
　
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月12日（金）

松浪、横井川

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。
↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。

↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
↓ddH2O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓ddH2O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1
0.1890.2080.1920.1900.191

　平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。

サンプル5
0.2820.2760.2780.2690.269

平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月15日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
8月8日と同じであるが、Annealingについて以下のように変更した。
DIAP2   　　　  　　　　 56.9℃
API2-MALT1 　　　　　53℃

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月16日（火）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
8月8日と同じであるが、Annealingについて以下のように変更した。
DIAP2    　　　  　　 　　　　 58.9℃
API2-MALT1        　　　　　53℃

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月17日（水）

松浪、横井川


【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2　　　　  　　 　　　　 50.5℃
API2-MALT1　　　　　　　 53.5℃

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

　　 ８/23(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　  1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　           　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
　　　　　　　　　　
　　　　　　　・DIAP2
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec
               ・API2-MALT1
　　　　　　　　　　 Annealing              ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       3 min


       <3>                                   72℃　　　　10 min
       <4>                                     4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月24日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec


        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月25日（木）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
　 ・API2-MALT1
  （1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec

    ・DIAP2
　（1）PCR反応液の調製()
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　  1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　           　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。






9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　  1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃
　　　　　　 R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>   
　　　　・API2-MALT1
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT            57.8 ℃
              R primer
                 GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA              56.5 ℃
              増幅サイズ　　約3131 bp
　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
            　         Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec


        上記の条件でPCRを行った。



【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。 　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃
　　　　　　 R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           　　　 
 
　
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】←ぷろとこるをコピペする！！
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
　　　PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓3 M  酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
　　　↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
　　　↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
　　　↓乾燥後、milliQ44 µLを加えて攪拌した。
　　　この溶液にXhoIを1 µL、10×H Bufferを5 µLを加え、37℃で20時間静置した。



9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】←ぷろとこるをコピペする！！
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
　　　PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓3 M  酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
　　　↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
　　　↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
　　　乾燥後、TE44 µLを加えて攪拌し-20℃で保存した。













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