Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/DIAP2-MALT9

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９月１日

Member

武田

DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cyle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 100sec End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

正しい位置にバンドが見られた。

９月５日

Member

横井川

1日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

９月６日

Member

横井川

1日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した。

９月７日

Member

横井川

QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからDIAP2のDNAを抽出した。

Results

バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

12th, September

Member

Matsunami, Yokoigawa

To amplify DIAP2 cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions.

F primer GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT

Tm value　　　　62 °C

R primer GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA

Tm value　　　　66.4°C

amplicon size　　1514 bp

PCR reaction 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min40sec End 4°C keep

９月１３日

Member

松浪、横井川

12日のPCR産物が増幅しているか確かめるため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2

期待される場所にバンドが見られた。

９月１４日

Member

松浪、横井川

API2-MALT1について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。

F primer GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT

Tm値　　　　57.8 °C

R primer GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA

Tm値　　　　56.5 °C

増幅サイズ　　約3131 bp

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。

９月１５日

Member

松浪、横井川

API2-MALT1、DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。

API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 53°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min 40sec End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1

DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。

９月１６日

Member

松浪、横井川

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

９月１７日

Member

松浪、横井川

制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。

９月１８日

Member

松浪

コンピテントセル（DH5α）を作成した。

９月１９日

Member

松浪

コンピテントセル（DH5α）を作成した。

９月２１日

Member

松浪

1.コンピテントセル（DH5α）を作成した。

2.DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

Results

1.ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2

全てのサンプルでPCRが成功した。

９月２２日

Member

不明★

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

９月２３日

Member

松浪

制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。

９月２５日

Member

松浪

コンピテントセル(DH5α)を作成した。

９月２７日

Member

松浪

コンピテントセル(DH5α)を作成した。