From 2011.igem.org
9/6(火)
吉村、中川
プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。
【実験方法】
ｐUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag
dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。
【実験結果】
F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
EcoRⅠ XbaⅠ
Tm値:72.14℃ 38塩基
R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
PstⅠ SpeⅠ
Tm値:72.16℃ 40塩基
9/12(月)
吉村、中川
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
| 10 µM Primer F | 1.5 µl |
| 10 µM Primer R | 1.5 µl |
| Template DNA | 1 µl |
| 10 x PCR Buffer for KOD Plus | 5 µl |
| dNTPs | 4 µl |
| MgSO4 | 4 µl |
| ddH2O | 32 µl |
| KOD Plus | 1 µl |
| | total 50 µl |
| | |
| Pre-Denature | 94°C | 2min | |
| Denature | 94°C | 15sec | 35 Cycle |
| Anneling | 55°C | 30sec |
| Extension | 68°C | 1min 20sec |
| End | 4°C | keep | |
|
| 10 µM Primer F | 1.5 µl |
| 10 µM Primer R | 1.5 µl |
| Template DNA | 1 µl |
| 10 x PCR Buffer for KOD Plus | 5 µl |
| dNTPs | 4 µl |
| MgSO4 | 2 µl |
| ddH2O | 34 µl |
| KOD Plus | 1 µl |
| | total 50 µl |
| | |
| Pre-Denature | 94°C | 2min | |
| Denature | 94°C | 15sec | 35 Cycle |
| Anneling | 55°C | 30sec |
| Extension | 68°C | 1min 20sec |
| End | 4°C | keep | |
|
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/13(火)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
| SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
| 1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
PCR条件(1)の方が少しバンドが濃くなっていた。
マーカーが流れてしまった。
【考察】
次回からPCR条件(1)の条件でPCRを行う。
マーカーが流れてしまったので、次回からは泳動時間を短くして電気泳動を行う。
Flag-tag dMLFの制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる
【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)
|
| MilliQ | 6.5 µl |
| Flag-tag dMLF | 20 µl |
| PstⅠ | 0.5 µl |
| 10 x H Buffer | 3 µl |
| | total 30 µl |
(2)
|
| MilliQ | 6.5 µl |
| Flag-tag dMLF | 20 µl |
| XbaⅠ | 0.5 µl |
| 10 x M Buffer | 3 µl |
| | total 30 µl |
(3)
|
| MilliQ | 6 µl |
| Flag-tag dMLF | 20 µl |
| PstⅠ | 0.5 µl |
| XbaⅠ | 0.5 µl |
| 10 x M Buffer | 3 µl |
| | total 30 µl |
37゜Cで50分間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。
ゲル1枚当たりの組成
|
| SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
| 1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
マーカーが開ききっていなかった。
【考察】
今回の実験ではFlag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかったが、制限酵素処理時間が短いという可能性があるため、制限酵素処理時間を長くして再度実験を行う。
また、マーカーのラダーが開ききっていないため、泳動時間が短かったと考えられる。
次回はゲルの濃度を2倍にして電気泳動を行う。
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の条件で4サンプルPCRを行った。
| 10 µM Primer F | 1.5 µl |
| 10 µM Primer R | 1.5 µl |
| Template DNA | 1 µl |
| 10 x PCR Buffer for KOD Plus | 5 µl |
| dNTPs | 4 µl |
| MgSO4 | 4 µl |
| ddH2O | 32 µl |
| KOD Plus | 1 µl |
| | total 50 µl |
| | |
| Pre-Denature | 94°C | 2min | |
| Denature | 94°C | 15sec | 35 Cycle |
| Anneling | 55°C | 30sec |
| Extension | 68°C | 1min 20sec |
| End | 4°C | keep | |
|
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/14(水)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
|
| SeaKemRGTGR-agar | 0.4 g |
| 1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れることがなかった。
Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。
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