Team:KIT-Kyoto/れおぽん実験9月
From 2011.igem.org
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+ | ↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<BR> | ||
+ | ↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた<BR> | ||
+ | ↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<BR> | ||
+ | ↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した<BR> | ||
+ | ↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<BR> | ||
+ | ↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<BR> | ||
+ | ↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<BR> | ||
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+ | 泳動後の写真<BR> | ||
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Revision as of 03:26, 26 September 2011
9/6(火)
吉村、中川
プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。
【実験方法】
pUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag
dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。
【実験結果】
F:AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
EcoRⅠ XbaⅠ
Tm値:72.14℃ 38塩基
R:AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC 9/12(月)
PstⅠ SpeⅠ
Tm値:72.16℃ 40塩基
吉村、中川
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
PCR条件(1)
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
PCR条件(2)
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 2 µl ddH2O 34 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/13(火)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.2 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
PCR条件(1)の方が少しバンドが濃くなっていた。
マーカーが流れてしまった。
【考察】
次回からPCR条件(1)の条件でPCRを行う。
マーカーが流れてしまったので、次回からは泳動時間を短くして電気泳動を行う。
Flag-tag dMLFの制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる
【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)
MilliQ 6.5 µl Flag-tag dMLF 20 µl PstⅠ 0.5 µl 10 x H Buffer 3 µl total 30 µl
(2)
MilliQ 6.5 µl Flag-tag dMLF 20 µl XbaⅠ 0.5 µl 10 x M Buffer 3 µl total 30 µl
(3)
MilliQ 6 µl Flag-tag dMLF 20 µl PstⅠ 0.5 µl XbaⅠ 0.5 µl 10 x M Buffer 3 µl total 30 µl
37゜Cで50分間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.2 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
マーカーが開ききっていなかった。
【考察】
今回の実験ではFlag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかったが、制限酵素処理時間が短いという可能性があるため、制限酵素処理時間を長くして再度実験を行う。
また、マーカーが開ききっていないため、泳動時間が短かったと考えられる。
次回はゲルの濃度を2倍にして電気泳動を行う。
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の条件で4サンプルPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/14(水)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.2 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真