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	Flag-tag dMLFの制限酵素処理<br>		Flag-tag dMLFの制限酵素処理<br>
	【目的】<br>		【目的】<br>
-	Flag-tag dMLFが途中で切れてしまわないかを調べる<BR>	+	Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、<em>Pst</em>Ⅰと<em>Xba</em>Ⅰの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中で<em>Pst</em>Ⅰと<em>Xba</em>Ⅰによって切れてしまわないかを調べる<BR>
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	【実験方法】<br>		【実験方法】<br>

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Revision as of 06:55, 25 September 2011

9/6(火)

吉村、中川

プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。

【実験方法】
ｐUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。


【実験結果】
F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ
Tm値:72.14℃　38塩基

R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
　　　　　PstⅠ　　　　　SpeⅠ
Tm値:72.16℃　40塩基

9/12(月)

吉村、中川


PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる

【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。

PCR条件(1) 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep

PCR条件(2) 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 2 µl ddH2O 34 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。

【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く


9/13(火)

吉村

アガロースゲル電気泳動
【目的】

【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成

SeaKemRGTGR-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
泳動後の写真

PCR条件(1)の方が少しバンドが濃くなっていた。

【考察】
次回からPCR条件(1)の条件でPCRを行う。
マーカーが流れてしまったので、次回からはゲルの濃度を濃くして電気泳動を行う。


Flag-tag dMLFの制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる

【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
10 x H Buffer	3 µl
	total 30 µl

(2)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

(3)

MilliQ	6 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

37゜Cで50分間インキュベートした。

【結果】