Team:KIT-Kyoto/れおぽん実験9月
From 2011.igem.org
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- | <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center> | + | <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center>94°C</td><td width="100px" align=center>2min</td></td><td width="100px"> </td></tr> |
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- | <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center> | + | <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center>94°C</td><td width="100px" align=center>2min</td></td><td width="100px"> </td></tr> |
- | <tr><td align=center>Denature</td><td align=center> | + | <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cyle</td></tr> |
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- | <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center> | + | <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min 20sec</td></tr> |
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Revision as of 09:41, 23 September 2011
9/6(火)
吉村、中川
プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。
【実験方法】
pUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag
dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。
【実験結果】
F:AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
EcoRⅠ XbaⅠ
Tm値:72.14℃ 38塩基
R:AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC 9/12(月)
PstⅠ SpeⅠ
Tm値:72.16℃ 40塩基
吉村、中川
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
PCR条件(1)
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cyle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
PCR条件(2)
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 2 µl ddH2O 34 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cyle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/13(火)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.2 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
【考察】