Team:KIT-Kyoto/れおぽん実験９月

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Revision as of 13:01, 20 September 2011

9/6(火)

吉村、中川

プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。

【実験方法】
ｐUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。

【実験結果】
F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ
Tm値:72.14℃　38塩基

R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
　　　　　PstⅠ　　　　　SpeⅠ
Tm値:72.16℃　40塩基

9/12(月)

吉村、中川

PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる

【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。

PCR条件(1)

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cyle
Anneling	(Tm-5)°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

PCR条件(2)

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	34 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cyle
Anneling	(Tm-5)°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。

【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く

9/13(火)

吉村

アガロースゲル電気泳動
【目的】

【実験方法】

【結果】

【考察】

@@ Line 49: / Line 49: @@
 <tr><td align=center>PCR条件(1)</td></tr>
 </table>
-<table border=1 width="250px">
+<table border=1 width="220px">
-<tr><td width="150px" align=center>10 µM Flag-MLF Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>10 µM Flag-MLF Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>鋳型 DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
@@ Line 58: / Line 58: @@
 <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>全量 50 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
 </td><TD></TD><TD></TD><td>
@@ Line 64: / Line 64: @@
 <tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 </table>
-<table border=1 width="300px">
+<table border=1 width="400px">
-<tr><td width="100px" align=center>Start</td><td width="200px"  align=right>95°C、30秒</td></tr>
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>95°C</td><td width="100px"  align=center>30sec</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-<tr><td align=center rowspan=3>Cycle x 30</td><td align=right>95°C、30秒(熱変性)</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cyle</td></tr>
-<tr><td align=right>(Tm-5)°C、1分(アニーリング)</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>1min</td></tr>
-<tr><td align=right>68°C、1kb/分(伸長)</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
-<tr><td align=center>End</td><td align=right>4°Cで保持</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 </table>
 </td></tr>
 </table>
 <br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
 <tr><td align=center>PCR条件(2)</td></tr>
 </table>
-<table border=1 width="250px">
+<table border=1 width="220px">
-<tr><td width="150px" align=center>10 µM Flag-MLF Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>10 µM Flag-MLF Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>鋳型 DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
@@ Line 85: / Line 87: @@
 <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>全量 50 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
 </td><TD></TD><TD></TD><td>
@@ Line 91: / Line 93: @@
 <tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 </table>
-<table border=1 width="300px">
+<table border=1 width="400px">
-<tr><td width="100px" align=center>Start</td><td width="200px"  align=right>95°C、30秒</td></tr>
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>95°C</td><td width="100px"  align=center>30sec</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-<tr><td align=center rowspan=3>Cycle x 30</td><td align=right>95°C、30秒(熱変性)</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cyle</td></tr>
-<tr><td align=right>(Tm-5)°C、1分(アニーリング)</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>1min</td></tr>
-<tr><td align=right>68°C、1kb/分(伸長)</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
-<tr><td align=center>End</td><td align=right>4°Cで保持</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 </table>
 </td></tr>