Team:KIT-Kyoto/ぷろとこる

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Revision as of 07:26, 19 September 2011

ぷろとこるうｐページ(^ω^)/

LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する

LBプレート

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる

トランスフォーメーション

去年のコピペばーじょん☆
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与える
↓0.9 mlのSOC培地を加える
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく
↓37°Cで一晩培養する

今年のシエロさんにもろたプリント☆
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える
↓氷上で15分間冷やす
↓43°Cで30秒間熱ショクを与える
↓氷上で10分間冷やす
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する
↓LB(+amp)プレートに塗る
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する

アルカリミニプレップ

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

去年のこぴぺ
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる
↓1 mlの70%エタノールを加える
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす

今年のミニプレ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する

ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
★DNAサンプル入力	★入力
Lording Dyi	7 ml

↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 µlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

テーブルタグ

テーブルタグ2

テーブルタグ

れお、中川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cyle
Anneling	(Tm-5)°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

松浪くん、横井川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
★Ex Taqばーじょん！

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cyle
Anneling	(Tm-5)°C	30sec
Extension	72°C	1kb/min
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

@@ Line 197: / Line 197: @@
 <table border="0"><tr><td>テーブルタグ</td><td>テーブルタグ2</td><td>テーブルタグ</td></tr></table>
-<font color="#ec6d71">れお、中川くんのやつ</font>
+<font color="#ec6d71">れお、中川くんのやつ</font><br>
-下記の組成に従って試薬をまぜる
+下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
-右に示したプログラムで反応を行う
+右に示したプログラムで反応を行う<br>
+<font color=red>(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！</font><br>
 <table border="0"><tr><td>
@@ Line 205: / Line 206: @@
 <tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 </table>
-<table border=1 width="250px">
+<table border=1 width="220px">
-<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>鋳型 DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
@@ Line 214: / Line 215: @@
 <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>全量 50 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
 </td><TD></TD><TD></TD><td>
@@ Line 220: / Line 221: @@
 <tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 </table>
-<table border=1 width="300px">
+<table border=1 width="400px">
-<tr><td width="100px" align=center>Start</td><td width="200px"  align=right>95°C、30秒</td></tr>
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>95°C</td><td width="100px"  align=center>30sec</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-<tr><td align=center rowspan=3>Cycle x 30</td><td align=right>95°C、30秒(熱変性)</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cyle</td></tr>
-<tr><td align=right>(Tm-5)°C、1分(アニーリング)</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>1min</td></tr>
-<tr><td align=right>68°C、1kb/分(伸長)</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
-<tr><td align=center>End</td><td align=right>4°Cで保持</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<BR>
+<font color="#ec6d71">松浪くん、横井川くんのやつ</font><br>
+下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
+右に示したプログラムで反応を行う<br>
+<font color=red>(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！</font><br>
+★Ex Taqばーじょん！<BR>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cyle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 </table>
 </td></tr>