From 2011.igem.org
9/6(火)
吉村、中川
プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。
【実験方法】
pUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag
dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。
【実験結果】
F:AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
EcoRⅠ XbaⅠ
Tm値:72.14℃ 38塩基
R:AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
PstⅠ SpeⅠ
Tm値:72.16℃ 40塩基
9/12(月)
吉村、中川
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
10 µM Primer F | 1.5 µl |
10 µM Primer R | 1.5 µl |
Template DNA | 1 µl |
10 x PCR Buffer for KOD Plus | 5 µl |
dNTPs | 4 µl |
MgSO4 | 4 µl |
ddH2O | 32 µl |
KOD Plus | 1 µl |
| total 50 µl |
| | |
Pre-Denature | 94°C | 2min | |
Denature | 94°C | 15sec | 35 Cycle |
Anneling | 55°C | 30sec |
Extension | 68°C | 1min 20sec |
End | 4°C | keep | |
|
10 µM Primer F | 1.5 µl |
10 µM Primer R | 1.5 µl |
Template DNA | 1 µl |
10 x PCR Buffer for KOD Plus | 5 µl |
dNTPs | 4 µl |
MgSO4 | 2 µl |
ddH2O | 34 µl |
KOD Plus | 1 µl |
| total 50 µl |
| | |
Pre-Denature | 94°C | 2min | |
Denature | 94°C | 15sec | 35 Cycle |
Anneling | 55°C | 30sec |
Extension | 68°C | 1min 20sec |
End | 4°C | keep | |
|
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/13(火)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
PCR条件(1)の方が少しバンドが濃くなっていた。
マーカーが流れてしまった。
【考察】
次回からPCR条件(1)の条件でPCRを行う。
マーカーが流れてしまったので、次回からは泳動時間を短くして電気泳動を行う。
Flag-tag dMLFの制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる
【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)
|
MilliQ | 6.5 µl |
Flag-tag dMLF | 20 µl |
PstⅠ | 0.5 µl |
10 x H Buffer | 3 µl |
| total 30 µl |
(2)
|
MilliQ | 6.5 µl |
Flag-tag dMLF | 20 µl |
XbaⅠ | 0.5 µl |
10 x M Buffer | 3 µl |
| total 30 µl |
(3)
|
MilliQ | 6 µl |
Flag-tag dMLF | 20 µl |
PstⅠ | 0.5 µl |
XbaⅠ | 0.5 µl |
10 x M Buffer | 3 µl |
| total 30 µl |
37゜Cで50分間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。
ゲル1枚当たりの組成
|
SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
マーカーが開ききっていなかった。
【考察】
今回の実験ではFlag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかったが、制限酵素処理時間が短いという可能性があるため、制限酵素処理時間を長くして再度実験を行う。
また、マーカーのラダーが開ききっていないため、泳動時間が短かったと考えられる。
次回はゲルの濃度を2倍にして電気泳動を行う。
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の条件で4サンプルPCRを行った。
10 µM Primer F | 1.5 µl |
10 µM Primer R | 1.5 µl |
Template DNA | 1 µl |
10 x PCR Buffer for KOD Plus | 5 µl |
dNTPs | 4 µl |
MgSO4 | 4 µl |
ddH2O | 32 µl |
KOD Plus | 1 µl |
| total 50 µl |
| | |
Pre-Denature | 94°C | 2min | |
Denature | 94°C | 15sec | 35 Cycle |
Anneling | 55°C | 30sec |
Extension | 68°C | 1min 20sec |
End | 4°C | keep | |
|
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/14(水)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
|
SeaKemRGTGR-agar | 0.4 g |
1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れることがなかった。
Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。
9/17(土)
吉村・横井川
ライゲーション
9/19(月)
トランスフォーメーション
【目的】
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに1~5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓0.9 mlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振とう培養した
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまいた
↓37°Cで一晩培養した
【結果】
制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる。
【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)
|
MilliQ | 6.5 µl |
Flag-tag dMLF | 20 µl |
PstⅠ | 0.5 µl |
10 x H Buffer | 3 µl |
| total 30 µl |
(2)
|
MilliQ | 6.5 µl |
Flag-tag dMLF | 20 µl |
XbaⅠ | 0.5 µl |
10 x M Buffer | 3 µl |
| total 30 µl |
(3)
|
MilliQ | 6 µl |
Flag-tag dMLF | 20 µl |
PstⅠ | 0.5 µl |
XbaⅠ | 0.5 µl |
10 x M Buffer | 3 µl |
| total 30 µl |
37゜Cで18時間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。
ゲル1枚当たりの組成
|
SeaKemRGTGR-agar | 0.4 g |
1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
9/20(火)
アルカリミニプレップ
【目的】
形質転換した大腸菌からプラスミドDNAを回収、精製する。
【実験方法】
|
Solution I | 50 mM グルコース (MW 180) |
| 10 mM EDTA(pH 8.0) |
| 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) |
Solution II | 0.2 N NaOH |
| 1% SDS |
Solution III | 3 M 酢酸カリウム |
| 1.8 M 酢酸 |
↓前日にプレカルチャーした1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつした
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁した
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心した
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとった
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てた
↓1 mlの70%エタノールを加えた
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分~15分乾かした
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かした
【結果】
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