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Team:KIT-Kyoto/GFP-MLF実験
From 2011.igem.org
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<table border="0"><tr><td> | <table border="0"><tr><td> | ||
<table border="0" width="150px"> | <table border="0" width="150px"> | ||
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr> | <tr><td align=center>PCR条件</td></tr> | ||
</table> | </table> | ||
| - | <table border=1 width=" | + | <table border=1 width="250px"> |
| - | <tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width=" | + | <tr><td width="150px" align=center>10 µM GFP Primer F</td><td width="100px" align=right>1.5 µl</td></tr> |
| - | <tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr> | + | <tr><td align=center>10 µM GFP Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr> |
| - | <tr><td align=center> | + | <tr><td align=center>鋳型 DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr> |
<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr> | <tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr> | ||
<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr> | <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr> | ||
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<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr> | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr> | ||
<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr> | <tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr> | ||
| - | <tr><td> </td><td align=right> | + | <tr><td> </td><td align=right>全量 50 µl</td></tr> |
</table> | </table> | ||
</td><TD></TD><TD></TD><td> | </td><TD></TD><TD></TD><td> | ||
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<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr> | <tr><td align=center>Cycle条件</td></tr> | ||
</table> | </table> | ||
| - | <table border=1 width=" | + | <table border=1 width="300px"> |
| - | <tr><td width="100px" align=center> | + | <tr><td width="100px" align=center>Start</td><td width="200px" align=right>95°C、30秒</td></tr> |
| - | <tr><td align=center | + | <tr><td align=center rowspan=3>Cycle x 30</td><td align=right>95°C、30秒(熱変性)</td></tr> |
| - | <tr><td align= | + | <tr><td align=right>(Tm-5)°C、1分(アニーリング)</td></tr> |
| - | <tr><td align= | + | <tr><td align=right>68°C、1kb/分(伸長)</td></tr> |
| - | <tr><td align=center>End</td><td align= | + | <tr><td align=center>End</td><td align=right>4°Cで保持</td></tr> |
</table> | </table> | ||
</td></tr> | </td></tr> | ||
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| + | <tr><td><table border=1 width="170px"> | ||
| + | <tr><td width="100px" align=center>LB培地</td><td width="70px" align=right> </td></tr> | ||
| + | <tr><td align=center>bacto-agar</td><td align=right>15 g/l</td></tr> | ||
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| + | ↓LB培地を作製し、1 lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した<BR> | ||
| + | ↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した<BR> | ||
| + | ↓65°C程度に冷まし、クロラムフェニコールを加えた<BR> | ||
| + | ↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した<BR> | ||
| + | ↓水平な所に置いて固まらせた<BR> | ||
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フェノクロ処理 | フェノクロ処理 | ||
Revision as of 02:14, 30 September 2011
GFPとMLFの実験系の実験ノートまとめ！
8/22(月)
吉村、中川、松浪
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)のトランスフォーメーション
【目的】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)の増殖
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した。
↓前もって冷やしておいた1.5 mLチューブに100 µLのコンピテント細胞を分注した。
↓BBa_E0240をチューブに1 µL加え、氷上で30分間冷やした。
↓42゜Cで45秒間熱ショックを与えた。
↓1 mLをLBプレート(+amp)にまいた。
↓37 Cで一晩インキュベートした。
【結果】
コロニーの生育がみられた。
8/23(火)
吉村、中川
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)のプレカルチャー
【目的】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)の増殖
【実験方法】
LB/amp 液体培地(50 µg/mL)2 mLで6サンプルを37゜Cで一晩、振とう培養した。
【結果】
全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
開始コドンなしのGFPのプライマー設計
【目的】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)から開始コドンなしのGFPを単離・増殖する。
【実験方法】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)から開始コドンなしのGFPの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。
【結果】
以下のようにプライマーを設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATT CGTAAAGGAGAAGAA
EcoRⅠ XbaⅠ
Tm値:67.75゜C 33塩基
R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
PstⅠ SpeⅠ
Tm値:67.66゜C 36塩基
8/24(水) 11:00～
吉村、中川
BBa_E0240のアルカリミニプレップ
【目的】
形質転換した大腸菌からBBa_E0240のプラスミドDNAを回収、精製する。
【実験方法】
↓前日のプレカルチャーで培養した培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスした
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4゜Cで10分間遠心した
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄した
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスした
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37゜Cで培養した
【結果】
制限酵素処理に続く
制限酵素処理
【目的】
提出用ベクターに組み込むインサートの調整
【実験方法】
下表に従って、制限酵素処理を行った。
| MilliQ | 0.3 µl |
| BBa_E0240 | 5 µl |
| EcoRⅠ | 0.5 µl |
| PstⅠ | 0.5 µl |
| 10 x Buffer | 0.7 µl |
| 全量 7 µl |
37゜Cで30分間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。
ゲル1枚当たりの組成
| SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
| 1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
800bpあたりにバンドが出ていた。
8/25(木) 11:00～
吉村、中川
PCR
【目的】
8/23に作製したプライマーを用いてGFPの特異的配列を増幅させる
【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
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【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
LBプレート作成
【実験方法】
| LB培地 | |
| bacto-agar | 15 g/l |
↓LB培地を作製し、1 lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した
↓65°C程度に冷まし、クロラムフェニコールを加えた
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した
↓水平な所に置いて固まらせた
フェノクロ処理 ↓前回泳動した残りサンプルを合わせて135μlにした
↓ddH2O65μl加えて全量を200μlにした
↓フェノール/クロロホルムを等量入れた
↓しっかりvoltexして、15000rpm,5分,25℃で遠心した
↓水層を別のエッペンに入れた（下の層がフェノール層）
↓次にクロロホルムのみで同様におこない、水層を別のエッペンに移した
↓1/10等量の3M酢酸ナトリウムを加えた
↓等量のイソプロパノールを加え、よく振った
↓12000rpm,20分25℃で遠心した
↓沈殿をとらないように上澄みだけ除いた
↓70%エタノールを200μl加えた
↓軽く混ぜた後12000rpm,10分,25℃で遠心
↓上澄みを除いた後乾燥させて長期保存ならTE、すぐに使うのでddH2O50μlに溶かした
電気泳動
↓3本のＤＮＡ溶液サンプル 5μlにddH2O0.3ml EcoR1 0.5μlPst1 0.5μl10×Buffer 0.7μlを 加え37℃30分インキュベート
↓１%agaゲル20μlより0.2gのagaを使いそこにTMNを20ml加えてゲルとする
↓電子レンジで沸騰させて粒がなくなった後ゲルが固まるまで待つ
↓1kbaseのマーカー5μlとDNAのLoading dye(×6)1μlとサンプル5μlとを足したもので計七個のサンプルをゲルの穴に注ぐ
↓電気泳動 100V 30分
↓EtBr染色(手袋をつけて) 10分
↓紫外線ランプを付けた元で撮影
制限酵素処理
先ほどのDNA溶液50μlと切りたい場所の制限酵素（今回はPst1,EcoR1）を1μl、Bufferを使用する制限酵素にあわせたものを6μl（今回は10×H Buffer）、ddH2Oを2μlを混ぜたものを37℃でインキュベートした 8/26
(目的)
大腸菌のベクターのトランスフォーム
(方法)
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓0.9 mlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまいた
↓37°Cで一晩培養した
(結果)
赤色のコロニーが多く生えてきた。GFPの色が赤色のDNAより大きく問題はなさそうであった。
8/25(木) 11:00～
吉村、中川
PCR
【目的】
8/23に作製したプライマーを用いてGFPの特異的配列を増幅させる
【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
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【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
8/26(金) 17:00～
ゲルからのDNA抽出
【目的】
GFPバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。
【実験方法】
QIAquick
Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x
TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとマーカーをゲルにのせた
↓50
Vで60分間電気泳動した1 kbpマーカー 3 ml noATG GFP 50 µl Lording Dye 7 ml
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50 Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
【結果】
濃度は510
ng/µlだった。
ゲル切り出し後の写真
pSB1C3のトランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3の増殖
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した。
↓前もって冷やしておいた1.5 mLチューブに100 µLのコンピテント細胞を分注した。
↓pSB1C3をチューブに1 µL加え、氷上で30分間冷やした。
↓42゜Cで45秒間熱ショックを与えた。
↓1 mLをLBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
小さいが、コロニーが生えていた。
念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。
8/27(土)
吉村
pSB1C3のトランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3の増殖
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した。
↓前もって冷やしておいた1.5
mLチューブに100 µLのコンピテント細胞を分注した。
↓pSB1C3をチューブに1 µL加え、氷上で30分間冷やした。
↓42゜Cで45秒間熱ショックを与えた。
↓1 mLをLBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
8/29
(目的)
大会提出用ベクターPsb1C3の培養とアルカリミニプレップ
(方法)
8/26に培養した提出用ベクターのコロニーの生えたプレートを用いた
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した
↓プレートからシングルコロニーを分離した
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した
(結果)
翌日コンタミしてると考えられるビン3本培養に成功したビンが3本できた
ただ念を入れて翌日同じ操作を行うことにした。
8/30
(目的)
大会提出用ベクターpsb1c3の培養→トラフォ(二回目)
(方法)
8/26に培養した提出用ベクターのコロニーの生えたプレートを昨日同様用いた
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
(結果)
翌日6本培養したがコンタミすることなく無事に大腸菌を回収することができた
8/31
(目的)
培養した菌液のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、電気泳動、制限酵素処理
アルカリミニプレを最初に行った。
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養するSolution I 50 mM グルコース (MW 180) 10 mM EDTA(pH 8.0) 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) Solution II 0.2 N NaOH 1% SDS Solution III 3 M 酢酸カリウム 1.8 M 酢酸
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する
