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From 2011.igem.org

DIAP2、MALT実験系９月！
9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 °C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min40sec End 4°C keep

上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2
期待される場所にバンドが見られた。


9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 °C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 °C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 53°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min 40sec End 4°C keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62°C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ
　　約1514 bp


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

vector PUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 µl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

37°Cで20時間静置した。



9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x M Buffer 5 µl XbaⅠ 1 µl   total 50 µl

API2-MALT1 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x L Buffer 5 µl Nhe Ⅰ 1 µl   total 50 µl

9月17日（土）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。

DIAP2	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。


9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル（DH5α）の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl2H2O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加した。
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。


9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

【目的】
・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2
全てのサンプルでPCRが成功した。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl 9月22日（木） 【目的】 PCR産物の制限酵素処理 【実験操作】 ↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。 ↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。 ↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。 ↓水層のみを新しいチューブに移した。 ↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。 ↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。 ↓水層のみを新しいチューブに移した。 ↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。 ↓15000g、4°Cで10min遠心した。 ↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。 ↓15000g、4°Cで5min遠心した。 ↓上澄みを捨て、乾燥させた。 ↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。 下記の組成に従って反応液を調整した。 DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x M Buffer 5 µl XbaⅠ 1 µl   total 50 µl 9月23日（金） 松浪 【目的】 制限酵素処理の確認 【実験操作】 制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。 DIAP2 2 µl ddH2O 8 µl 6 x loading dye 2 µl 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。 EtBr染色を行い、写真を撮った。 【結果】 マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。 9月25日（日） 松浪 【目的】 コンピテントセル(DH5α)の作成 【実験操作】 SOB培地(1 L) bacto tryptone 20 g bacto yeast extract 5 g 5M NaCl 2 mL 2K KCl 1.25 mL ↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。 ↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。 Transformation Buffer(TB) PIPES 1.5 g CaCl2H2O 1.1 g KCl 9.3 g ↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解した。 ↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせた。 ↓MnCl2H2Oを5.45 g添加した。 ↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。 ↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。 9月27日（火） 松浪 【目的】 コンピテントセルの作成 【実験操作】 ↓OD600＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。 ↓4°Cで10min遠心(4.5 x 103 g)した。 ↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。 ↓氷上で10 min保冷した。 ↓4°Cで10min遠心(5 x 103 g)した。 ↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。 ↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。 ↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。 ↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。 Retrieved from "http://2011.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DIAP2-MALT%E5%AE%9F%E9%A8%93%EF%BC%99%E6%9C%88" Recent changes What links here Related changes Special pages My preferences Printable version Permanent link Privacy policy Disclaimers